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技术文章

美国nightsea SFA DFP荧光滤光片的选择指南

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   由于GFP(绿色荧光蛋白)和其他绿色发光体(例如FITC)是使用广泛的荧光染料,因此我们的宝蓝色激发/发射装置是体视镜荧光适配器常用的选择。在黄色Longpass和绿色bandpass屏障滤波器选项之间进行选择时,经常会要求我们提供建议。本文将介绍每种方法的优缺点。

光谱特性

  • Longpass –传输所有大于500nm的波长
  • bandpass –仅在500 – 560nm之间传输

长波和带通滤光片,用于宝蓝色激发

实际上,这意味着bandpass仅传输绿色波长,而Longpass则传输绿色,黄色,橙色和红色。

滤光片作用

     荧光应用中任何滤光片的目的都是为了增加您想要看到的东西(“信号”)的观看对比度。主要工作是阻挡来自激发源的反射光并透射荧光发射。其他潜在的干扰源(“噪声”)是观看区域中其他物质的荧光,这些物质可以掩盖目的信号。这可能是来自诸如生长培养基(与秀丽隐杆线虫一起使用时)或对象本身的一部分(例如植物中的叶绿素或发育中的斑马鱼卵黄)之类的背景荧光。

Longpass滤光片和bandpass滤光片都可以很好地阻挡激发光。

尽管您可能会认为选择与预期释放量紧密匹配的滤光片会更好,但这并非总是如此。

    如果您要消除的噪声与信号没有重叠,则bandpass是一个不错的选择。例如,在拟南芥或其他植物中,叶绿素发出的红色荧光就是这种情况,如下图所示*。叶绿素发出远红色的光,其峰值在约685 nm处。在使用Longpass滤光片制作的左侧图像中,红色荧光难以区分绿色GFP荧光。绿色的bandpass滤光片消除了这种情况,使您很容易看到叶子中的GFP荧光。

 

用长通滤光片成像的拟南芥荧光(c)夜海
带通滤光片对拟南芥荧光成像(c)夜海

      如果噪声与信号频谱重叠,则bandpass滤波器可能会引起混淆。使用Longpass滤波器,您可以通过两种潜在的方式将信号与噪声区分开:强度和 颜色。使用bandpass滤镜,您可以删除颜色(光谱),而仅保留强度。下面的荧光转基因斑马鱼图像说明了这一点。这条鱼**在心脏中表达GFP,在血细胞中表达mCherry。下图是两幅图像的合成-一幅是使用Longpass滤波器拍摄的,另一幅是使用绿色bandpass滤波器拍摄的。

通过长通(顶部)和带通滤光片拍摄的转基因荧光斑马鱼

通过Longpass(顶部)和bandpass滤光片拍摄的转基因荧光斑马鱼

     在顶部图像中,您可以看到绿色荧光的心脏,红色荧光的血细胞和蛋黄的天然黄色荧光。这些很容易区分。在下部图像中,所有内容均以不同的绿色强度显示。心脏明亮,但蛋黄没有那么暗。说所有绿色都与GFP表达有关是不正确的。在这种情况下,*使用Longpass滤镜观看物体。

      在某些情况下,选择不太明显。秀丽隐杆线虫的生长培养基具有一些背景绿色荧光。与黄色长通相比,绿色bandpass滤镜确实增加了一些清晰度和对比度。在许多测试中,我们让数名观察员观察了相同的样本。有些人喜欢长通,因为他们认为这实际上有助于查看背景的某些背景,而另一些人则喜欢同一样品的带通。在这种情况下,很可能还有其他选择,选择并不*明显,可能取决于个人喜好。

如果您正在自然探索荧光?长传肯定是要走的路。您无法使用带通滤镜捕获此草花的图像。

显微镜下的香蓟属,荧光(c)Charles Mazel

 

拟南芥  由波士顿大学的John Celenza博士提供。

**斑马鱼由Martha Marvin博士(威廉姆斯学院)提供,这是由Lara Hutson博士(布法罗大学)培育的转基因品系。