无基质（Scaffold-Free）3D细胞球体的制备解析-上海溪拓科学仪器有限公司

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无基质（Scaffold-Free）3D细胞球体的制备解析

更新时间：2023-02-21

细胞在体内紧密的空间排列使得单个细胞之间以及细胞与细胞外基质之间能够进行复杂的相互作用。这种排列为细胞提供了的线索，以指导特定的细胞功能和生长。为了在体外复制这种空间排列，可以在三维（3D）培养系统中培养细胞，使细胞与细胞聚集形成球体。让细胞聚集成细胞球体的无基质（SCAFFOLD-FREE）3D细胞球体培养是构建3D细胞球较为常见的方法。其原理基于贴壁细胞趋向于聚集的生物特性，如肿瘤细胞、肝细胞等。

现阶段，已有多种方法构建细胞球体，如维持细胞在培养基中的悬浮培养（悬滴法、磁悬浮法、旋转培养法），或是利用低粘附孔板（U型板等）。不同的培养方法优缺点是怎样的？该如何选择？相应的3D细胞球体检测和分析方法有哪些？本期，EFL从3D细胞球体的制备、检测及应用三方面进行阐述，供大家参考与学习。

Scaffold-Free 3D 细胞球体制备方法

1. 悬滴法

简介：细胞通过重力沉积在悬挂液滴的底部，并逐渐形成球状体。将一小滴细胞悬液（体积为10-30μL）种植在微孔板的盖子上，然后将微孔板倒置，使细胞在重力作用下积聚在液滴的底部。

优点：具有高通量制备细胞球状体的潜力。

缺点：悬滴法通常涉及小体积液体操作，定期更换培养基和细胞染色都需要较高的实验操作技能。此外，它耗时且劳动密集，难以实现3D多细胞球体的长期培养。

2. 磁悬浮

简介：利用磁场将含有纳米颗粒的氧化铁细胞团簇在一起形成球状体。

优点：可控制细胞群的几何形状，能实现不同种细胞在共培养过程中的多细胞聚集。

缺点：细胞球体的大小和形状难以控制，均匀性差。

3. 旋转培养

简介：通过模拟微重力将细胞保持在动态液体中。沿其水平轴旋转培养容器以混合细胞。通过调节反应器的速度，可以将流体冲击力和剪切力降至。形成3D细胞球体后，反应器继续以特定速度旋转，以防止球体相互聚结。

优点：可模拟人体内的动态条件，适用于细胞的长期培养，便于大规模生产等。

缺点：培养系统依赖性大，培养对象只能是各相同性的组织和器官，如软骨、肝等，不适于各相异性的组织器官。

4. 超低粘附 U 型底多孔板

简介：非贴壁表面方法使细胞聚集成球状体，尽可能的降低细胞贴附、蛋白吸收和酶活性，维持细胞以悬浮不贴壁的状态生长。

优点：非粘附表面培养方法方便简洁，可实现3D球体的长期培养和异质细胞的共培养。

缺点：对细胞活性要求较高，并不适用于所有细胞形成细胞球。

细胞球体检测方法

1. 形态分析

光学显微镜：可测量直径、面积、周长、固体度、圆度和球形度等属性。

电子显微镜可以观察到粗糙度、孔隙、通道和其他参与细胞-细胞相互作用的结构，存在结构倒塌、制备和镀金步骤导致球体形态发生变化的风险。

聚焦离子束扫描电子显微镜(FIB-SEM)可自动生成z轴分辨率较高的三维图像，近年来已被应用于大尺度三维球体成像。

透射电镜技术则用于更详细地分析球体中的超微结构区室。

2. 细胞活力定性分析，用于三维内部结构和细胞周期的表征

共聚焦激光扫描显微镜：可以观察球体的不同层，对于光线穿透受阻的大球体的分析不太有效，可通过将球体冷冻切片来解决。然而，由于切割过程本身，切片可能会产生三维结构的形态畸变，需要使用软件工具将切片连接起来，重建完整的球体图像。

光片荧光显微镜(LSFM)：不需要样品切片就可观察样品3D结构，能够穿透更深的样品。但双光子的信号很弱，采集速度非常慢，不适合对大样品进行动态成像，其成本较昂贵。

双光子和多光子显微镜系统：具有超高灵敏度的直接探测器能记录组织深层最细微的内部结构，可有效地收集来自深层组织的微弱光子，使图像更明亮。

3. 球状体中活细胞的定量

球状体中活细胞的数量可以通过直接方法(如手动或自动计数)和间接方法(通过比色法和生物发光测定)来确定。

直接法：球体必须分解成单独的细胞，这一过程的难度取决于组成球体的细胞类型以及细胞产生的ECM的特征。

间接法包括比色法和生物发光法。比色法基于细胞摄取染色剂的能力，当分离或聚集成球状时，球体内化合物扩散的定量方法可能会显示差异。生物荧光法被证明更可靠、更敏感、显色化合物干扰更低、速度更快，因为不需要染色潜伏期，而使用其他方法时可能需要几个小时。

具体的检测方法可参考往期EFL推文“细胞增殖与活性检测的“规矩"?总有一条适用你"

4. 基因表达谱

蛋白质印迹法（免疫印迹试验）即Western Blot可识别细胞裂解液中转录的蛋白质的存在，它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。

5. 细胞代谢

目前用于分析球形代谢功能的分析可以使用分析细胞外流的设备，并通过细胞外酸化率测量糖酵解，通过耗氧率测量氧化磷酸化。

6. 人类细胞图谱（HCA）

HCA方法，这项技术是提高图像捕获效率、图像处理算法和开发可靠的数据分析软件的结果。HCA有潜力应用于单个细胞、构成球体的一组特定亚群或整体聚集的荧光标记的分析，而不需要细胞分离。HCA需要自动显微镜，通常是荧光或共聚焦显微镜，以及强大的数据分析和存储软件，这导致初始投资很高。

细胞球体应用

1、药物疗效和毒性试验:药物筛选

2、器官发育和先天性疾病的探究

3、大规模组织工程的发展：生物制造

4、生物3D打印

5、增加系统复杂性:微流体和高通量平台